El equipo de los G.I. Joe, liderado por Roadblock (Dwayne Johnson), Duke Hauser (ChanningTatum) y Snake Eyer (Ray Park), se ve obligado a enfrentarse de nuevo a la amenaza del Comandante Cobra (Faran Tahir), que se apoya en sus secuaces Firefly (Ray Stevenson), Storm Shadow (Lee Byunghun), y sobre todo Zartan (Arnold Vosloo), para llevar a cabo un plan absolutamente retorcido. Aprovechando que Zartan se está haciendo pasar por el presidente de los Estados Unidos (Jonathan Pryce), éste logra convencer a los principales líderes mundiales de que los G.I. Joe son una amenaza, logrando acabar con casi todos, asi como apuntar cientos de misiles nucleares a pueblos inocentes de todo el mundo. Superados, los G.I. Joe deciden llevar adelante un plan desesperado para darle la vuelta a la situación, iniciando una operación denominada «Segunda Revolución Americana», que gira en torno al retorno a la acción del creador original del equipo, el general Joseph Colton (Bruce Willis).
